Brotherhood je pokračováním úspěšné hry Assassin’s Creed II. Stejně jako ve druhém díle, i zde se hráč ujímá nájemného zabijáka Ezia Auditore, který v rozhodující chvíli neprojevil dostatek rozhodnosti, a tak musí dokončit to, co začal. Kromě krátkého intermezza v Monteriggioni na začátku a několika odskočení během pozdějších fázích hry, se tentokrát celý děj odehrává v hlavním městě Itálie, v Římě, kde končil děj druhého dílu.
Na cestě za pomstou pomáhají Eziovi opět známé historické osobnosti jako třeba Niccol? Machiavelli, Leonardo Da Vinci či Catarina Sforza.
